人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后心肌特异性肌钙蛋白I的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：人脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，经诱导后是否可向心肌细胞分化？目前的报道尚不多。
目的：观察人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导分化后肌钙蛋白I的表达情况。
方法：取第2代人脐带间充质干细胞标本，经消化、离心、沉淀后，分为7份，制成细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁷ L^-1，分别加入浓度为80，40，20，10，5，2.5，0 μmol/L 5-氮胞苷于同样条件继续培养，作用24 h后除去，继续培养4周。
结果与结论：①人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷处理24 h之后，各组细胞都会出现部分死亡，失去典型的梭形形态，成为棍状或者柱状，40，80 μmol/L组细胞形态变化明显。②免疫组化染色显示5，10，20，40，80 μmol/L组诱导后2周心肌特异性肌钙蛋白I表达呈阳性，对照组与2.5 μmol/L组心肌特异性肌钙蛋白I表达为阴性。选取5个高倍视野进行细胞计数，80，40，20，10 μmol/L组间心肌样细胞的转化率差异无显著性意义，均明显高于5 μmol/L组(P < 0.05)。③超微结构观察显示经5-氮胞苷诱导后4周时部分人脐带间充质干细胞内可见典型的肌小节及心房颗粒。而未经5-氮胞苷诱导的对照组无以上改变。结果提示经5-氮胞苷诱导后人脐带间充质干细胞能够向心肌样细胞转化。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 脐带间充质干细胞, 5-氮胞苷, 免疫组化, 心肌细胞, 肌钙蛋白I, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells possess multi-differentiation potential. There are few studies describing whether human umbilical cord mesenchymal stem cells can be induced to differentiate into cardiomyocytes .
OBJECTIVE: To investigate cardiac troponin I expression in human umbilical cord mesenchymal stem cells after 5-azacytidine induction in vitro.
METHODS: Passage 2 human umbilical cord mesenchymal stem cells were digested, centrifuged and deposited. Cell suspension was prepared and cell concentration was adjusted to be 2×10⁷/L. Then cells were cultured for 24 hours after addition of various concentrations of 5-azacytidine (80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 μmol/L). After removal of 5-azacytidine, cells were cultured for another 4 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: After treatment with 5-azacytidine for 24 hours, some cells died in each group, and typical fusiform appearance turned into stick-like or column-like appearance, especially in the 40 and 80 μmol/L 5-azacytidine groups. Immunohistochemical staining results showed that cardiac troponin I expression was detected in human umbilical cord mesenchymal stem cells in 5, 10, 20, 40, 80 μmol/L 5-azacytidine groups after induction for 2 weeks, but it was not detected in the control and 2.5 μmol/L 5-azacytidine groups. Five high-fold fields were selected for cell counting. The number of cardiomyocytes was not significantly different between 80, 40, 20, 10 μmol/L 5-azacytidine groups, but it was significantly higher compared to that in the 5 μmol/L 5-azacytidine group. After 5-azacytidine treatment for 4 weeks, typical sarcomeres and cardiac atrium particles were observed in some human umbilical cord mesenchymal stem cells. Such changes were not observed in the control group in which 5-azacytidine induction was not used. These findings suggest that human umbilical cord mesenchymal stem cells were induced to cardiomyocyte-like cells by 5-azacytidine.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, umbilical cord mesenchymal stem cells, 5-azacytidine, immunohistochemistry, cardiomyocyte, cardiac troponin I, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

唐欣，王妮妮，易海波，王岩，庞天舒. 人脐带间充质干细胞经5-氮胞苷诱导后心肌特异性肌钙蛋白I的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(23): 4212-4215.

Tang Xin, Wang Ni-ni, Yi Hai-bo, Wang Yan, Pang Tian-shu. Cardiac troponin I expression in human umbilical cord mesenchymal stem cells after 5-azacytidine induction in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(23): 4212-4215.

图/表（结果） 4

2.1 倒置显微镜观察细胞形态改变 在5-氮胞苷处理前，无细丝样结构、无颗粒，胞浆量均匀且少，核/浆比例高，细胞形态是典型的梭形，细胞呈漩祸样或同心圆生长，核内会见到较为明显的核仁，见图1；在5-氮胞苷处理24 h之后，梭形转变为棍状或者柱状，80，40，20 μmol/L组有30%细胞出现死亡，10，5，2.5 μmol/L组仅有少量细胞死亡，部分细胞黏附生长，见图2。

诱导7 d后，细胞形态发生变化，多紧密平行排列生长，细胞体积变大，纺锤形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形。诱导两三周时细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，40，80 μmol/L组细胞形态变化明显。
2.2 免疫组化鉴定结果 免疫组化染色显示5，10，20，40，80 μmol/L组诱导后2周心肌特异性肌钙蛋白I表达呈阳性，对照组与2.5 μmol/L组心肌特异性肌钙蛋白I表达为阴性，见图3。

2.3 人脐带间充质干细胞经诱导后向心肌样细胞的转化率 选取5个高倍视野进行细胞计数，80 μmol/L 5-氮胞苷组心肌样细胞的转化率为(24.1±5.6)%，40 μmol/L 5-氮胞苷组为(21.2±5.2)%，20 μmol/L 5-氮胞苷组为(23.3±5.6)%，10 μmol/L 5-氮胞苷组为(28.3±3.6)%， 5 μmol/L 5-氮胞苷组为(15.6±4.2)%。80，40，20，10 μmol/L组间差异无显著性意义，均明显高于5 μmol/L组(P < 0. 05)。
2.4 透射电镜观察诱导后细胞超微结构 诱导后4周，对照组与2.5 μmol/L组的细胞表面有诸多突起，细胞核形态不规则，核染色质呈弥散样分布，电子密度低，核仁清晰，部分核可见多个核仁，胞质内细胞器形态分化幼稚，线粒体小且电子密度很高。5，10，20 μmol/L组的细胞胞浆内线粒体丰富，核位于细胞中央，多为单核，少量细胞为双核或者多核，核周围聚集有丰富的房性颗粒样结构，直径在100-200 nm，见图4。40，80 μmol/L组的细胞大量死亡，未行电镜观察。

参考文献

引言

材料方法

设计：细胞学对比观察实验。
时间及地点：实验于2009年12月至2010年12月在辽宁医学院完成。
材料：人脐带间充质干细胞由细胞产品国家工程研究中心提供。5-氮胞苷、抗人cTnI单抗(Sigma公司)，倒置显微镜、透射电子显微镜(日本Olympus公司)。
实验方法：
体外培养诱导方法：取2份第2代人脐带间充质干细胞标本， 0.25%胰蛋白酶消化后，500×g离心5 min。离心后进行沉淀，用无血清DMEM培养液将其进行混匀，分为7份，清洗2次，制成细胞悬液，调整细胞浓度为2×10⁷ L^-1，分别加入浓度为80，40，20，10，5，2.5，0 μmol/L 5-氮胞苷于同样条件继续培养，作用24 h后，吸去含5-氮胞苷的培养液，洗涤2次(Tyrode氏平衡盐溶液)，改用完全培养液继续培养，每3 d换液1次。
诱导心肌样细胞的鉴定：
人脐带间充质干细胞的形态观察和细胞生长情况：在倒置显微镜下观察诱导前，诱导后24 h，48 h，1周，2周，3周，4周细胞生长和形态的变化。
免疫组织化学方法检测心肌特异性肌钙蛋白I的表达：诱导2周后，在室温下用PBS洗涤人脐带间充质干细胞的盖玻片，然后再将其放入到比例为1∶1的冰乙酸∶甲醇液体中洗涤3次，固定20 min，加入37 ℃的二抗、鼠抗人β-肌球蛋白重链进行洗涤。细胞浆中的阳性细胞会出现棕黄色颗粒。
超微结构观察：诱导4周后，收集细胞，消化离心、戊二醛固定、环氧树脂包埋，制成电镜超薄切片，经醋酸双氧铀和构椽酸铅双染后透射电镜观察细胞的超微结构。
心肌样细胞转化率：取诱导后的细胞爬片，每张玻片取5个视野，对视野内的蓝色细胞核数、肌钙蛋白I阳性细胞数进行计数，计算人脐带间充质干细胞经诱导后向心肌样细胞的转化率。
统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，用SPSS 13.0统计软件分析。两两组间比较用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

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